可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/04/29 19:24:12

可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?
可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?

可溶性表达的蛋白如何纯化?纯化后如何除咪唑?
1,破细胞,高速离心收上清收集上清（同时平衡好柱子）；
2,既然你是His-tag,用Ni-NTA之类的柱子,两次上柱,buffer平衡；
3,低浓度咪唑（5mM）洗5-10柱体积,以洗去杂蛋白；
4,过梯度咪唑（10-500MM）,用紫外检测仪监测280nm,收下每个峰；
5,用峰液跑SDS-PAGE,看哪个峰的蛋白浓度和纯度最为理想；
6,脱咪唑以及换buffer、脱盐,有两种基本方法：A,透析（经济、简便）；B,用脱盐柱（需要有仪器及柱子,更简便更省时）.
关于您说的蛋白没有活性的问题,我建议您在脱咪唑之前,就用峰液去测活性（如果咪唑不影响活性的检测手段）,一般来讲,咪唑不会对蛋白的活性有太大影响.如果脱咪唑之前就已经没有活性,那就不是脱咪唑的问题,而是要往前追溯问题.比如,有无移码、tag对蛋白性质影响如何、破细胞的方法是否影响蛋白等等.
对可溶性蛋白的表达及纯化,我有多年经验,若有疑问,欢迎继续讨论.

BL21表达的蛋白，先用裂解液测粗酶活，看看是否有活性。

你表达的蛋白不带纯化标记么？蛋白带his标记，目前的情况是用钴离子柱纯化后杂蛋白太多。纯化后用不含咪唑的洗脱液进行透析，想除去咪唑。这样做完后检测蛋白功能，发现蛋白没有活性。怀疑是纯化和透析咪唑出了问题。所以想请教大家：如何让我的目的蛋白更纯，咪唑能除干净是不是纯化的柱子有问题呢？...

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你表达的蛋白不带纯化标记么？

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